Materiale og metoder

Eksperimentet ble utført fra januar 2017 til april 2018. Bakterier som ble brukt var Streptococcus mitis CCUG (Culture Collection of University of Gothenburg, Sweden) 31611 og 42984, Streptococcus mutans UAB (University of Alabama at Birmingham, USA) 159, Actinomyces naeslundi 10301, Streptococcus salivarius CCUG 11878 og Escherichia coli ATCC (American Type Culture Collection) 25922 (294). Laboratoriestammer ble bevisst brukt i stedet for kliniske isolater, da disse sannsynligvis ikke hadde blitt eksponert for biocider tidligere og derfor ikke hadde utviklet redusert følsomhet for disse.

Dyrkningsbetingelser var 5 dager på standard blodagar-medier ved 37°C i 5% CO2 i luft. Eksperimentet ble gjennomført på faste vekstmedier siden CHX-desinfisering i hovedsak utføres på overflater og at bakterier i flytende kultur er mer følsomme for antimikrobielle stoffer. Etter å ha oppnådd optimal vekst, ble mikroorganismene dyrket på blodagar med forskjellige konsentrasjoner av klorheksidin glukonat (CHX) (Sigma Aldrich, Oslo, Norge). I tillegg ble de ført videre på de ovenfor nevnte blodskålene.

Etter overføring fra rene blodskåler ble alle de 6 testorganismene startet på 0,06% CHX-blodagar, noe som tilsvarer konsentrasjonen av kjente, reseptfrie CHX-produkter til daglig bruk. I tilfelle de ikke vokste ved denne CHX konsentrasjon, ble bakterier overført to ganger til med 5-dagers intervaller fra basale (CHX-frie blodagar plater) til 0,06% CHX blodagar. Tre gjentatte negative overføringer ble akseptert som bevis på følsomhet for den CHX-konsentrasjonen som ble testet. Når den første følsomheten var etablert, ble CHX-konsentrasjonen i vekstmediet redusert til 0,01%, 0,005% til 0,001%, ved å bruke samme prosedyre for å etablere følsomhet som beskrevet ovenfor.

Etter å ha etablert vekst i nærvær av 0,001% CHX i alle teststammene unntatt en, ble CHX-konsentrasjonen økt trinnvis via 0,005%, 0,01%, 0,05%, 0,12%, til eksperimentet ble avsluttet med 0,2% CHX. Ved hver konsentrasjon, hvor testbakteriene ikke vokste, ble kopier av bakteriestammen fra den forrige lavere konsentrasjonen av CHX, hvor bakterien hadde vokst, testet på nytt. Tre gjentatte negative overføringer ble akseptert som følsomhet for den CHX-konsentrasjonen, selv om de hadde vist følsomhet ved en lavere.

Hvis det ikke ble observert vekst på en CHX-plate etter 5-dagers kultur, ble platens overflate skrapt av og overført til en ren blodagarskål for å se om innholdet i avskrapet ville vokse på CHX-fritt medium (dvs. test toleranse (9) igjen). Hvis det var vekst på en plate, ble den overført til en blodagarplate med samme konsentrasjon av CHX som den mikroorganismen ble høstet fra, og holdt på denne konsentrasjonen i 10 overføringer for å bli miljøtilpasset før ytterligere eksponering for høyere konsentrasjoner. Overlevende bakterier ble frosset ned ved -90°C. En kopi ble oppbevart i kjøleskap for verifisering, mens en annen kopi ble overført til plater med økende CHX-konsentrasjon.

Resultater

Opprinnelig ble alle stammer utsatt for 0,06 % CHX. Unison in vitro resistens (følsomhet) for synkende CHX-konsentrasjoner ble vist helt ned til 0,001 %, der alle stammer - unntatt S. salivarius - vokste. Blant de orale bakteriene overlevde kun A. naeslundi høyere konsentrasjoner (0,01%). Alle de testede orale stammene var sensitive for høyere CHX-konsentrasjoner, og ingen viste sovende overlevelse (dvs. toleranse eller utholdenhet (9)) i nærvær av CHX. E. coli, viste derimot ervervet in vitro resistens mot 0,2 % CHX, sluttkonsentrasjonen for dette eksperimentet, og den høyeste konsentrasjonen i reseptfrie orale skyllemidler i Norge. Tabell 1 viser hvilke CHX-konsentrasjoner de forskjellige bakteriestammene var i stand til å vokse på etter å ha vist resistens ved 0,001 %.

Diskusjon

Resultatene av dette enkle eksperimentet har vist at flere av de opprinnelig CHX-følsomme bakteriene overlevde høyere konsentrasjoner av biocidet etter at de in vitro ble utsatt for subkliniske konsentrasjoner av CHX (tabell 1). Etter å ha vist vekst ved 0,001% CHX, var E. coli i stand til å vokse ved 0,2% CHX. I denne studien fokuserte vi på å teste konsentrasjoner av orale CHX-skyllevæsker (0,06%, 0,12%, 0,2%), siden disse representerer markedssegmentet som bidrar mest til det totale forbrukervolumet av CHX (8).

Dette eksperimentet registrerte ikke den minimale veksthemmende konsentrasjonen (minimum inhibitory concentration = MIC), og heller ikke den minimale bakteriedrepende konsentrasjonen (minimum bacteriocidal concentration = MBC) av CHX. Det var et in vitro eksperiment med et lite antall organismer, men bør kunne sees på som et «proof of concept». Kommersielle testsystemer for CHX resistens finnes ikke på markedet enda, men vil nødvendigvis bli utviklet etter som dette problemet blir mer omfattende. Klinisk utføres de fleste profylaktiske CHX-prosedyrer på overflater, og dermed kan et in vitro-eksperiment, som det presenteres her, være nok til å trekke forsiktige konklusjoner fra. CHX-resistens er et stigende problem (6) og noen forskere har i innlegg og diskusjoner tatt til orde for helt å avskaffe bruken av CHX i tannbehandling, selv om det ikke finnes støtte for dette i litteraturen. Tvert imot, men med forsiktighet, indikerer dette eksperimentet og litteraturoversikten noe annet som diskutert nedenfor.

Bakteriell resistens mot CHX er rapportert hos flere bakteriearter, inkludert E. coli, Klebsiella spp, Klebsiella pneumoniae, Enterobacter spp, Salmonella spp, Pseudomonas spp, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas stutzeri, Acinetobacter spp, Acinetobacter baumannii, Acinetobacter anitratus, Proteus spp, Proteus mirabilis, Staphylococcus aureus, MRSA, koagulase-negative stafylokokker, Staphylococcus epidermidis, Enterococcus faecium, Enterococcus faecalis, Bacillus subtilis, VRE (vancomycin-resistant enterococcus gjennomgått i ref. 6) og vanlige karies - og periodontittassosierte bakterier (10,11).

CHX angriper produksjonen av fosfolipider og proteiner i bakteriens cytoplasmamembran (12). Inaktivering, permeabilitetsreduksjon og spesielt effluksmekanismer er mekanismer som hittil er beskrevet (13, 14). Dermed, og ikke overraskende, har kryssresistens blitt vist med antibiotika (6, 15 - 17). Selv om kromosombundne mutasjoner er foreslått (13), ser de fleste av disse resistensgenene ut til å være plasmidbundet (18, 19), noe som kan forklare lateral spredning av CHX-resistens (19, 20).

Våre resultater indikerer at det er liten mulighet for å utvikle CHX-resistens i orale bakterier ved kort tids eksponering mot terapeutiske konsentrasjoner (dvs. 2–3 uker med 0,2 - 0,1% CHX) i orale skyllevæsker. Det er faktisk vist at plakk (biofilm)-inhiberende effekt av 1% CHX (10 mg/g) tannkrem var uendret etter to års kontinuerlig bruk (21), og at den bakteriologiske sammensetningen av tungefloraen var uendret etter fire måneders skylling med høye konsentrasjoner (0,1%, 0,2%) av CHX (22). Imidlertid kan kontinuerlig bruk av lavkonsentrert CHX (0,06%, 0,05%) to ganger daglig, som er anbefalt av produsenter, ikke utelukkes som mulig kilde til lokal resistensutvikling. Dette skyldes at skyllevæskekonsentrasjoner (0,05%, 0,06% CHX) vil reduseres i nisjer i munnhulen siden munnslimhinnen fungerer som et depot for frigjøring av CHX i opptil 12 timer etter skylling (23). Således, hvis det er en nedre konsentrasjonsgrense der orale bakterier kan bli CHX-ufølsomme, som i det herværende eksperiment, kan situasjonen i munnhulen etter skylling to ganger daglig med lavkonsentrert CHX over lengre perioder favorisere seleksjon av CHX-ufølsomme orale bakterier. Selv små mengder CHX vil uunngåelig bli svelget og på samme måte, og hypotetisk, bli presentert for tarmfloraen, der E. coli er rikelig representert, i konsentrasjoner som kan generere CHX ufølsomhet. Enda viktigere er at slike konsentrasjoner av CHX, anbefalt i daglige skylleprodukter, er vist uten klinisk verdi for forbrukeren (24).

At E. coli utviklet stabil CHX ufølsomhet ved 0,001% CHX, og at in vitro-resistens mot høyere og profylaktiske konsentrasjoner også ble vist, er bekymringsfullt. Slike lave, resistensgenererende gradientkonsentrasjoner av CHX finnes teoretisk i nærheten av behandlingssteder hos enkeltpasienter og deres omgivelser ved og kort tid etter behandling. Imidlertid eksponerer ikke disse CHX konsentrasjonene kontinuerlig mikroorganismene, som f.eks. den daglige og langsiktige bruken av orale CHX-skyllevæsker der ufølsomhet kan oppstå over tid. På den annen side er det funnet lave og resistensgenererende konsentrasjoner av CHX i kloakk og avløpsvann fra sykehus, tannklinikker, bedrifter og til og med boligsamfunn, hvor CHX brukes (25, 26) daglig. Her vil CHX-produkter uten nyttig klinisk effekt (24) eller etter ineffektive kliniske CHX-dekontaminasjonsprosedyrer (6), derfor kun bidra til resistensgenererende avløpsvannkonsentrasjoner. I dette miljøet, der E. coli er rikelig representert, vil CHX-ufølsomhet uunngåelig forekomme, og spredning fra denne nisje til insekters, fisk, menneskers og andre dyrs mikrobiomer uunngåelig skje (27). En klorheksidinresistent A. hydrophila har allerede blitt isolert fra en drikkevannskilde (28), et alarmerende funn på grunn av denne bakteriens evne til å spre seg i vann, inkludert drikkevannsbassenger, samt å skape infeksjoner hos mennesker og andre dyr. Den alvorligste utviklingen av CHX-ufølsomhet vil derfor sannsynligvis ikke finne sted på stedet for bruk og terapi, men i kloakk og avløpsvann fra menneskelig aktivitet (29).